[혈우병 임상검사] 발색분석법(Chromogenic Assay)

원칙

FVIII는 FIXa와 Ca2+가 있을때 인지질 표면에서 FX가 FXa로 변환하는 것을 가속합니다. 따라서 FIXa, FX, 인지질 및 Ca2+로 이루어진 희석된 검사 표본의 혼합물에서, FX가 표본에서 FVIII:C 수치에 의존하는 정도까지 활성화(FXa형성)됩니다. 특정 FXa(S-2756)에 대하여 합성 발색 기질을 추가하고, 비색법으로 자유롭게 된 P-NA를 측정하여 간접적으로 FVIII:C를 결정합니다. 
이 방법을 위한 도구 (Test Team, Chromogenix)는 상업적으로 이용할 수 있습니다. 

방법

1. 표본(검사 혈장 또는 정상혈장)을 플라스틱 시험관 안에서 인지질/FXa/FX의 혼합물에 추가하고 37도에 5분 동안 가온합니다. 

2. CaCl2를 추가하고 37도에서 5분을 더 가온한 후 합성 발색 기질(S-2756)의 용액을 추가합니다. 측정을 기록하는 방법은 두 가지가 있습니다. 

FXa 형성의 초기 비율은 초기 측정값을 구하고, 그 다음 규칙적인 간격으로 측정값을 구하여 결정 할 수 있습니다. 단점법은 기질 용액을 추가한 뒤 5분후에 반응을 종료하기 위해 20%아세트산을 사용하고, 유출된 pNA를 추정합니다. 

3. FVIII:C를 가로 좌료로 하고, 흡광 변화 또는 흡광 자체를 세로좌표로 지정한 후 희석된 일반 혈장을 사용하여 검량선을 준비합니다. 검사 혈장에서 대응하는 FVIII:C(%)는 이 곡선에서 추론합니다. 혈장 희석물을 조정하여, FVIII:C 가 20~150%인 높은 농도 범위와 FVIII:C가 1~20%인 낮은 농도 범위 모두에서 측정할 수 있습니다.